基因型

F- ompT hsdS(rB-mB-) gal dcm(DE3)pLysS Camr

簡(jiǎn)要說明

BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞攜帶pLysS質(zhì)粒，具有氯mei素抗性。pLysS含有表達(dá)T7 溶jun酶的基因，T7溶jun酶可以作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌，能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)，適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)（DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶），BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率高達(dá)108cfu/μg。

操作說明

1. 取100μl冰上融化的BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞，加入目的質(zhì)粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

   2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

   3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌2YT或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘

   4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含34 µg/ml氯mei素及所選質(zhì)粒篩選抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。 

   5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。

   2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

   3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

   4.誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2mM均可）

   5.為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。

   6.BL21(DE3)pLysS 菌株攜帶pLysS質(zhì)粒，除復(fù)蘇培養(yǎng)基為無抗生素外，其余所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)液均應(yīng)含有34µg/ml氯mei素，以防質(zhì)粒丟失。